練習(xí)1：簡短閱讀程序集

對于第一個練習(xí)，我們將使用數(shù)據(jù)作為單個讀取。如果您有雙端數(shù)據(jù)，通常不會這樣做，但我們只是演示匯編程序如何管理未配對的數(shù)據(jù)。選擇包含讀取的兩個文檔（正向讀取和反向讀取）。

現(xiàn)在單擊??Align / Assemble?并選擇De Novo Assemble?，然后在窗口左下角的Settings cog下單擊Reset to defaults?。在結(jié)果部分下，選擇保存程序集報告并保存到子文件夾中。保留共有序列已開啟，因為我們要將它們映射回原始參考序列以查看它們匹配的程度。

Click?OK. This should produce an assembly with 4 contigs which will be placed in the Assembly subfolder.

Two of these are very short, the others much longer as you can see from the?Assembly Report. When there are multiple contigs produced, this document will also give you the?N50 statistic?which is a commonly used measure of the quality of an assembly.

要查看這些重疊群如何與原始序列對齊，請選擇De Novo Assembly Tutorial?父文件夾，然后單擊新的Assembly?文件夾，以查看兩者的內(nèi)容。按住cntrl /命令，選擇Consensus Sequences?和NC_009487提取文檔。現(xiàn)在選擇對齊/組裝→映射到參考。檢查NC_009487是否設(shè)置為參考序列，然后單擊確定。

一旦這個程序集完成后，您可以查看重疊群，并查看組合的重疊群與原始序列的映射情況。您應(yīng)該看到有一個區(qū)域匯編程序遇到麻煩，無法加入它生成的最長重疊群。

在程序集中選擇此區(qū)域（大約90,000）并放大。您應(yīng)該看到有一部分沒有重建重疊群，這就是為什么兩個最長的重疊群無法連接的原因。在下一個練習(xí)中，我們將看看使用配對結(jié)束信息是否有幫助。

練習(xí)2：組裝雙端數(shù)據(jù)

所提供的數(shù)據(jù)實際上是125bp的雙末端讀數(shù)，插入大小約為500bp。為了在Geneious中使用雙端讀取，需要將這兩組讀取組合為一個配對讀取文件，其中包含有關(guān)其方向和距離的額外信息。為此，請選擇正向和反向讀取文檔，然后從頂部菜單中選擇序列→設(shè)置配對讀取...。您有兩個序列表，請選擇序列對列表，然后選擇預(yù)期距離為500的正向/反向（Illumina短讀取試劑盒），然后單擊確定。

現(xiàn)在你有一個Paired Reads?文件，所以你可以選擇這個文件，然后再次運行Align / Assemble→De Novo Assemble ...?和以前相同的設(shè)置。這一次，匯編器將能夠使用配對信息來幫助它定位讀取的位置并希望重現(xiàn)原始序列。

完成后，將制作的共有序列與先前相同的方式映射回NC_009487序列：選擇De Novo Assembly Tutorial?父文件夾和新的Paired Reads Assembly?文件夾，然后選擇NC_009487提取和新的共識序列，然后單擊對齊/組裝→映射到參考。

您現(xiàn)在應(yīng)該可以看到最后的重疊群幾乎是原始序列的全長，但“?統(tǒng)計”?選項卡將顯示序列不是100％相同的。您可以使用CTRL / CMD + D單步執(zhí)行錯誤，或查看身份圖以檢查錯誤。由于原始數(shù)據(jù)中的錯誤，會有幾個位置在裝配中不明確。在最后的練習(xí)中，我們將在共識中糾正這些基調(diào)。

練習(xí)3：共識糾正

返回上一練習(xí)中的配對讀數(shù)組合文件夾并打開重疊群。為了確定變異的位置，選擇Annotate＆Predict→Find Variations / SNPs?并重置為默認(rèn)值，然后將Minimum Coverage?值更改為4，因為覆蓋率很低的區(qū)域會對變體調(diào)用做出貢獻(xiàn)。這些可能是組裝不良或閱讀錯誤的產(chǎn)物，但將它們稱為SNP將使我們能夠輕松找到它們。保留最小變化頻率設(shè)置并取消選中最大變量P值和最小股數(shù)偏置P值因為我們只是使用SNP查找器更容易地在共識代中查找這些錯誤。點擊確定。

一旦變異已被調(diào)用，在共有序列中的第340?位選擇它們中的第一個，然后放大該基地。這一組變體是由于讀取結(jié)束附近的缺口缺失的低覆蓋區(qū)域中的未對準(zhǔn)引起的。由于使用的評分方法，對齊器難以完成讀取結(jié)束時的差距。

單擊“注釋和跟蹤”?選項卡中“變體”注釋控件旁邊的右箭頭，直到找到基于18033的變體。

該基因在共有序列中被稱為'R'，因為讀數(shù)在該位置包含A和G的混合物。進(jìn)入“顯示”選項卡中的共識設(shè)置，并根據(jù)0％ - 多數(shù)改變設(shè)置以調(diào)用。

您現(xiàn)在將看到該基地在共識中被稱為A。逐步通過其余變體來檢查在共有序列中調(diào)用的堿基是否反映了讀取中的大多數(shù)堿基，然后通過選擇整個序列并單擊提取將共有序列提取到新文檔。

注意：對于大多數(shù)數(shù)據(jù)集，通過“最高質(zhì)量”調(diào)用共識將產(chǎn)生最準(zhǔn)確的結(jié)果，并且是推薦的選項。但是，對于本教程，我們使用了一個小的低覆蓋率數(shù)據(jù)集，因此使用“0％多數(shù)”可產(chǎn)生較少的歧義。

將新的共有序列重新映射到NC_009487參考序列，并查看您現(xiàn)在是否能夠找到任何分歧。“?統(tǒng)計信息”?選項卡應(yīng)顯示對齊現(xiàn)在為100％，并且您已更正原始數(shù)據(jù)中的讀取錯誤。

您現(xiàn)在已經(jīng)完成了De Novo Assembly Tutorial。